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Scientific Reports volume 13, Artigo número: 12749 (2023) Citar este artigo

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A desregulação epigenética da cromatina é uma das marcas do desenvolvimento e progressão do câncer, e é continuamente investigada como um potencial biomarcador geral desta doença complexa. Um dos fatores nucleares envolvidos na regulação genética é a proteína DEK única - um acompanhante de histonas que modula a topologia da cromatina. Os níveis de expressão de DEK aumentam significativamente de células normais para células cancerígenas, aumentando assim a possibilidade de usar DEK como marcador tumoral. Embora se saiba que a DEK está implicada na regulação epigenética e transcricional, os detalhes destas interações e a sua relevância no desenvolvimento do cancro permanecem em grande parte indefinidos. Neste trabalho, investigamos a correlação espacial entre a distribuição nuclear dos padrões DEK e cromatina - juntamente com a progressão do câncer de mama - aproveitando a espectroscopia de correlação cruzada de imagens (ICCS) juntamente com a análise do Ensaio de Ligação de Proximidade (PLA). Realizamos nosso estudo no modelo baseado em três linhagens celulares de mama humana bem estabelecidas para considerar a heterogeneidade deste tumor (células MCF10A, MCF7 e MDA-MB-231). Nossos resultados mostram que a superexpressão de DEK se correlaciona com o nível geral mais alto de proximidade espacial entre DEK e marcas de histonas correspondentes às regiões promotoras de genes (H3K9ac, H3K4me3), embora não se correlacione com a proximidade espacial entre DEK e intensificadores de genes (H3K27ac). Além disso, observamos que as frações de colocalização de DEK e marcas de histonas são menores para o subtipo celular não invasivo do que para a linhagem celular altamente invasiva (MDA-MB-231). Assim, este estudo sugere que o papel da DEK nas regiões transcricionalmente ativas da cromatina varia dependendo do subtipo da linha celular de câncer de mama.

A condição fisiológica do DNA da cromatina é mantida com base em uma armada complexa de processos que funcionam em ação concertada para garantir a regulação do DNA. Dentre todos os mecanismos envolvidos, a modificação das histonas representa uma das marcas1. Estas modificações – por exemplo, acetilação, metilação, fosforilação e ubiquitinação – são frequentemente referidas como “o código epigenético”2, uma vez que influenciam a acessibilidade da maquinaria de transcrição ao ADN sem alterar diretamente a sequência do ADN. Na verdade, o código epigenético desempenha um papel crucial na orquestração da maioria dos processos relacionados com o ADN. Níveis não fisiológicos de modificações de histonas são comuns em várias doenças humanas - por exemplo, doenças autoimunes, doenças neurodegenerativas, doenças cardiovasculares e câncer3 - e, como tal, estão frequentemente envolvidos no processo de prognóstico4. Por exemplo, no contexto do câncer de mama, o desequilíbrio de acetilação e metilação das caudas de histonas resulta em uma abertura ou fechamento incomum da estrutura da cromatina5, e várias outras marcas epigenéticas, por exemplo, a ubiquitinação, são altamente desreguladas6,7,8,9, 10,11,12. De modo geral, a alteração do padrão epigenético normal poderia representar um dos primeiros passos no processo de transformação oncogênica13.

As modificações das histonas regulam a expressão genética modulando a acessibilidade espacial ao genoma de várias proteínas que estão envolvidas nas etapas do processo de transcrição - muitas vezes referidas como maquinaria de transcrição. No entanto, a modificação das histonas não é o único mecanismo que afecta a regulação genética: de facto, uma variedade de proteínas desempenha papéis significativos para este objectivo, estando envolvidas nas várias etapas do processo de transcrição. Um dos fatores celulares implicados na regulação gênica é a proteína DEK, também envolvida em diversos mecanismos oncogênicos14,15. A superexpressão da proteína DEK está consistentemente associada ao aumento da proliferação celular, progressão tumoral, mau prognóstico dos pacientes e, consequentemente, estágio avançado do câncer. Além disso, este fator nuclear onipresente liga-se a muitos genes altamente expressos e comumente expressos e está envolvido na regulação gênica em células de câncer de mama17. Dentro deste contexto, é de grande interesse investigar mais a fundo as interações da DEK com a estrutura aberta da cromatina. Para isso, escolhemos a microscopia de fluorescência confocal multicolorida, uma das ferramentas mais poderosas e versáteis para estudar a codistribuição espacial de proteínas nucleares. Para aumentar o conteúdo de informação recuperado pelos dados brutos de imagem, aproveitamos a análise de espectroscopia de correlação cruzada de imagens baseada em pixels (ICCS), recentemente aplicada em um contexto semelhante . Graças à abordagem ICCS, é possível caracterizar a colocalização de DEK com marcadores de cromatina, obtendo assim uma medição indireta de suas interações funcionais. Para poder validar essas interações potenciais, muitas vezes é benéfico complementar o ensaio de colocalização de imagens com técnicas in situ - por exemplo, transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) ou co-imunoprecipitação in vitro. Em nosso estudo, combinamos a análise ICCS com o Proximity Ligation Assay (PLA), uma solução promissora para visualizar a proximidade em escala nanométrica entre dois fatores rotulados . Na verdade, este método aproveita a imunocoloração indireta e um ensaio subsequente envolvendo enzimas para revelar as interações de proteínas endógenas separadas por menos de 40 nm23.