Sentindo o DNA

Engenharia Biomédica da Natureza (2023)Cite este artigo

3 Altmétrico

Detalhes das métricas

A quantificação de uma única molécula da força e especificidade de sequência das interações entre proteínas e ácidos nucleicos facilitaria a sondagem da ligação proteína-DNA. Aqui mostramos que os eventos de ligação entre a ribonucleoproteína Cas9 cataliticamente inativa e qualquer sequência curta predefinida de DNA de fita dupla podem ser identificados detectando mudanças na corrente iônica como nanoestruturas de DNA linear com código de barras adequadamente projetadas com saliências de DNA de fita dupla de ligação a Cas9 translocadas através de nanoporos de estado sólido. Projetamos nanoestruturas de DNA com código de barras para estudar as relações entre a sequência de DNA e a especificidade de ligação ao DNA, eficiência de ligação ao DNA e tolerância à incompatibilidade de DNA de Cas9 no nível de nucleotídeo único. A detecção baseada em nanoporos de nanoestruturas com código de barras de DNA pode ajudar a melhorar o projeto de ribonucleoproteínas eficientes e específicas para aplicações biomédicas, e pode ser desenvolvida em ensaios sensíveis de detecção de proteínas.

O reconhecimento de sequências de ácidos nucleicos por proteínas é fundamental para a biologia. Devido à especificidade da ligação proteína-DNA, as interações entre essas biomoléculas formam a base de muitas ferramentas de biossensor, técnicas de engenharia biomolecular e novas terapias . Em particular, os sistemas de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR)/dCas9 surgiram como ferramentas poderosas para a expressão genética direcionada, bem como para o diagnóstico, e um trabalho substancial está sendo realizado atualmente para melhorar a eficiência e a especificidade do CRISPR/Cas3,4. É, portanto, essencial desenvolver ensaios simples e sensíveis que analisem as interações entre ácidos nucleicos e proteínas nos seus estados dobrados e funcionais, para capturar o seu comportamento nativo. Além disso, é imperativo que estas metodologias sejam sensíveis às diferenças de sequência de nucleótidos únicos, o que pode ter um impacto dramático na ligação.

A detecção de pulso resistivo com nanoporos de estado sólido é um método atraente para avaliar eventos de ligação. A técnica oferece flexibilidade para estudar DNA, RNA e proteínas em seus estados nativos com um único sistema de detecção. A detecção de nanoporos depende da medição de mudanças na corrente iônica à medida que as moléculas são conduzidas através de um poro nanométrico usando um campo elétrico aplicado. A mudança da corrente iônica devido a um evento de translocação reflete o tamanho, forma e carga da molécula5. Existem dois tipos de nanoporos: biológicos e de estado sólido. Embora os nanoporos de proteínas derivados biologicamente sejam ideais para sequenciamento de DNA6, os nanoporos de estado sólido oferecem controle sobre o tamanho dos poros durante o processo de fabricação, permitindo a detecção de uma ampla gama de analitos.

Embora esta versatilidade permita a análise de uma variedade de biomoléculas, a falta de especificidade na detecção também apresenta um desafio para a detecção multiplexada, onde os alvos de interesse devem ser facilmente diferenciados. Para superar esta barreira, capitalizamos a nanotecnologia do DNA, que permite a concepção e montagem de nanoestruturas personalizadas que contêm locais de ligação específicos para proteínas de interesse7.

Neste artigo, fabricamos nanoporos de estado sólido puxando capilares de quartzo, também conhecidos como nanopipetas, para serem usados ​​como ferramenta de detecção geral. O DNA de fita dupla (dsDNA) cria uma queda de corrente iônica no sinal do nanoporo. Ao ligar um analito, como uma proteína, ao dsDNA, são criados picos de corrente secundários. Ao projetar sítios ou sequências de ligação específicas ao longo de uma fita de DNA, é produzido um padrão identificável. Esta impressão digital é observável como uma assinatura única de picos na corrente iônica. A marcação e mapeamento de sequências de DNA nativas direcionadas em nanoporos foram previamente realizadas usando uma variedade de métodos, incluindo sondas peptídicas de ácido nucleico8,9, ligação bioquímica10, fatores de transcrição11 e modificação química com metiltransferase e biotinilação12. Recentemente, o uso da análise de nanoporos para medir a ligação de uma variante de Cas9 cataliticamente inativo ou morto (dCas9) ao dsDNA foi demonstrado2,13 Nosso sistema se baseia nesses trabalhos iniciais de prova de conceito, introduzindo nanoestruturas de DNA projetadas para usuários. definiu testes de alvo de DNA, expandindo assim o espaço de aplicação de detecção de nanoporos, nanotecnologia de DNA e triagem de interações proteína-DNA. Aqui demonstramos que, quando cuidadosamente projetados e testados, os complexos dCas9 poderiam atuar como um marcador, permitindo o mapeamento altamente específico do DNA para determinar alterações em pares de bases únicos, o que é particularmente importante para o diagnóstico .